Risolvere il caso della contaminazione da RNasi

La contaminazione da RNasi può causare il caos nei laboratori di analisi dell'RNA. Quali sono questi problemi e come possono essere risolti?

RNase: Il solito sospetto

Le RNasi sono gli enzimi responsabili della degradazione dell'RNA negli organismi viventi. Svolgono un ruolo chiave nella maturazione delle molecole di RNA e sono una prima linea di difesa contro i virus contenenti RNA, così come nella scomposizione del vecchio RNA. Ci sono molti tipi diversi di RNasi, e il tipo principale utilizzato nei laboratori è la RNasi A, che mira specificamente all'RNA a singolo filamento.

La RNasi A è comunemente descritta come uno degli enzimi più resistenti nell'uso in laboratorio. Le RNasi sono generalmente molto ricche di legami disolfuro, che le rendono enzimi incredibilmente stabili e possono anche sopravvivere all'autoclave.

Mentre la RNasi è una componente necessaria di molti processi biologici, è meglio descritta come un dolore e un ostacolo per chi lavora nell'analisi dell'RNA.

È incredibilmente facile contaminare un laboratorio di sequenziamento dell'RNA con l'RNasi, ma è notoriamente difficile assicurarne la completa eliminazione. Ciò è dovuto alla presenza di RNasi ambientale in fonti microbiche nell'aria così come dalla pelle umana, dai capelli o dalla saliva.

Contaminazione: il crimine

Affinché gli esperimenti sull'RNA abbiano successo, sembra ovvio che le molecole di RNA debbano essere il più possibile intatte. Tuttavia, a causa dell'interferenza della RNasi, che rompe rapidamente le molecole di RNA quando sono presenti, questo spesso non è il caso. I ricercatori possono quindi avere anomalie gettate su di loro, risultati incoerenti, che causano frustrazione e confusione.

"Le RNasi sono pervasive e quando contaminano le superfici critiche possono presentare problemi per i laboratori impegnati nel sequenziamento e nell'analisi dell'RNA. Minuscole quantità di enzimi comuni, come la RNasi, possono rendere imprecisa una serie sperimentale. Le tecniche standard per la decontaminazione delle attrezzature di laboratorio possono richiedere ore", ha commentato Theresa Thompson, un application scientist di Phoseon Technology (OR, USA).

Contaminazione da RNasi

Impedire la presenza fisica della RNasi in un laboratorio "normale" sarebbe un'aspettativa irrealistica. Invece, gestire accuratamente la situazione è un'aspirazione più realistica. I ricercatori possono mantenere le contaminazioni da RNasi al minimo aprendo frequentemente nuovi prodotti monouso e usando nuove paia di guanti; una situazione che può sembrare fin troppo familiare al sempre attento analista di RNA. Oltre a questo, è comunque possibile inattivare le molecole di RNasi con vari metodi, arrestando la loro attività e rendendole inutili contro l'RNA.

Questi metodi attuali di inattivazione della RNasi tendono ad essere costosi, lunghi e dispendiosi. Essi comprendono il trattamento DEPC dell'acqua e l'autoclavaggio, la decontaminazione chimica delle superfici e il trattamento chimico delle attrezzature seguito dal risciacquo in acqua senza RNasi e dalla cottura della vetreria.

È difficile sapere quando un laboratorio è abbastanza pulito. Basta lasciare una pipetta su una scrivania per raccogliere l'RNasi dalle cellule epiteliali sparse o iniziare a usare un'attrezzatura autoclavata solo per iniziare immediatamente a dedurre nuove molecole di RNasi dall'aria. La sterilizzazione in autoclave non distrugge da sola tutta l'attività delle RNasi, poiché queste possono mantenere un'attività parziale quando si raffreddano a temperatura ambiente.

Mentre la pulizia chimica può disattivare l'enzima, lascia dei residui chimici che possono potenzialmente contaminare l'esperimento in altri modi.

C'è un metodo emergente di decontaminazione della RNasi che ha mostrato risultati promettenti ed è rapido e privo di sostanze chimiche. La luce UV può inattivare irreversibilmente la RNasi, con studi che dimostrano che ciò è possibile in meno di 1 minuto.

Che ci sia la luce!

Phoseon Technology ha sviluppato l'uso della luce UV per la decontaminazione della RNasi in una nuova tecnologia:

"La tecnologia KeyPro™ è un sistema di decontaminazione delle micropiastre con LED UV ad alta intensità. Un array di diodi emette una luce UV ad alta intensità in due lunghezze d'onda - 275 nm e 365 nm - che hanno dimostrato di inattivare la RNasi in modo rapido e affidabile. Mentre l'array scorre attraverso la camera di decontaminazione, la luce raggiunge tutte le aree esposte in alto del vetrino o della piastra", ha spiegato Thompson.

"L'inattivazione completa dei contaminanti di laboratorio, compresa la RNasi A, può essere realizzata dal sistema KeyPro in meno di 5 minuti e a una frazione del costo dei metodi tradizionali".

La tecnologia KeyPro è attualmente mirata alla decontaminazione di micropiastre, vetrini preparatori e piccole superfici e funziona tramite una serie di scansioni di LED UV in combinazione con una piattaforma ad altezza regolabile.

Il sistema KeyPro

L'uso della luce UV elimina molti dei problemi associati agli attuali metodi di decontaminazione. Non c'è bisogno di risciacquare ripetutamente le attrezzature in seguito con acqua priva di RNase e non ci sono residui chimici, il che riduce il tempo e la potenziale contaminazione attraverso altre vie. C'è anche una minore necessità di materiale monouso, riducendo i costi e i rifiuti.

Gli studi hanno anche dimostrato che tutte le comuni superfici di laboratorio, compresa la plastica, possono essere decontaminate in modo sicuro attraverso questo uso della luce UV.

È stato dimostrato che i protocolli che possono beneficiare di questo includono più tipi di sequenziamento dell'RNA, il profiling del ribosoma e il sequenziamento di prossima generazione degli RNA.

Si spera che questa tecnologia possa essere ulteriormente sviluppata per consentire la decontaminazione di pezzi più grandi di attrezzature, nonché la manipolazione delle lunghezze d'onda della luce, come ha concluso Thompson:

"Un modello con una camera più grande è previsto per una maggiore flessibilità in ciò che l'attrezzatura può essere decontaminata. Oltre a questo, abbiamo scoperto che altre lunghezze d'onda della luce possono essere utilizzate per manipolare la funzione della biomolecola, come accelerare l'attività enzimatica o denaturare selettivamente solo alcune parti della struttura molecolare di una proteina".

Tag:
Categorie: