Risolvere il caso di contaminazione da RNasi

Immagine di laboratorio da Biotechniques

La contaminazione da RNasi può causare caos nei laboratori di analisi dell'RNA. Quali sono questi problemi e come possono essere risolti?

RNase: il solito sospetto

La RNasi è l'enzima responsabile della degradazione dell'RNA negli organismi viventi. Svolgono un ruolo chiave nella maturazione delle molecole di RNA e sono una prima linea di difesa contro i virus contenenti RNA, nonché nella scomposizione del vecchio RNA. Esistono molti tipi diversi di RNasi, con il tipo principale utilizzato nei laboratori che è RNasi A, che si rivolge specificamente all'RNA a filamento singolo.

RNase A è comunemente descritto come uno degli enzimi più resistenti nell'uso di laboratorio. Le RNasi sono generalmente molto ricche di legami disolfuro, che le rendono enzimi incredibilmente stabili e possono persino sopravvivere alla sterilizzazione in autoclave.

Sebbene l'RNasi sia una componente necessaria di molti processi biologici, è meglio descritta come un dolore e un ostacolo per coloro che lavorano nell'analisi dell'RNA.

È incredibilmente facile contaminare un laboratorio di sequenziamento dell'RNA con RNasi, ma è notoriamente difficile assicurarne l'eradicazione completa. Ciò è dovuto alla presenza di RNasi ambientale in fonti microbiche nell'aria, nonché dalla pelle umana, dai capelli o dalla saliva.

Contaminazione: il crimine

Affinché gli esperimenti sull'RNA abbiano successo, sembra ovvio che le molecole di RNA devono essere il più intatte possibile. Tuttavia, a causa dell'interferenza della RNasi, che scompone rapidamente le molecole di RNA quando presenti, spesso non è così. I ricercatori possono quindi subire anomalie, risultati incoerenti, che causano frustrazione e confusione.

“Le RNasi sono pervasive e quando contaminano superfici critiche possono presentare problemi per i laboratori impegnati nel sequenziamento e nell'analisi dell'RNA. Minuscole quantità di enzimi comuni, come RNasi, possono rendere imprecisa una serie sperimentale. Le tecniche standard per la decontaminazione delle apparecchiature di laboratorio possono richiedere ore ", ha commentato Theresa Thompson, scienziata applicativa presso Phoseon Technology (OR, USA).

Contaminazione da RNasi

Prevenire la presenza fisica di RNase in un laboratorio "normale" sarebbe un'aspettativa irrealistica. Invece, gestire a fondo la situazione è un'aspirazione più realistica. I ricercatori possono ridurre al minimo le contaminazioni da RNasi aprendo frequentemente articoli monouso freschi e utilizzando nuovi paia di guanti; una situazione che può sembrare fin troppo familiare al sempre attento analista dell'RNA. Inoltre, è possibile inattivare le molecole di RNasi con vari metodi, arrestandone l'attività e rendendole inutili contro l'RNA.

Questi metodi attuali di inattivazione dell'RNasi tendono ad essere costosi, lunghi e dispendiosi. Includono il trattamento DEPC dell'acqua e la sterilizzazione in autoclave, la decontaminazione chimica delle superfici e il trattamento chimico delle apparecchiature seguito dal risciacquo in acqua priva di RNasi e dalla vetreria.

È difficile sapere quando un laboratorio è sufficientemente pulito. Tutto ciò che serve è lasciare una pipetta su una scrivania per prelevare l'RNasi dalle cellule epiteliali del capannone o iniziare a utilizzare un'apparecchiatura autoclavata solo per iniziare immediatamente a dedurre nuove molecole di RNasi dall'aria. Inoltre, la sterilizzazione in autoclave non distrugge tutta l'attività delle RNasi da sola, poiché possono mantenere un'attività parziale durante il raffreddamento a temperatura ambiente.

Sebbene la pulizia chimica possa disattivare l'enzima, lascia residui chimici che possono potenzialmente contaminare l'esperimento in altri modi.

Esiste un metodo emergente di decontaminazione della RNasi che ha mostrato risultati promettenti ed è rapido e privo di sostanze chimiche. La luce UV può inattivare irreversibilmente RNase, con studi che dimostrano che ciò è possibile in meno di 1 minuto.

Sia la luce!

Phoseon Technology ha sviluppato l'uso della luce UV per la decontaminazione dell'RNasi in una nuova tecnologia:

“La tecnologia KeyPro ™ è un sistema di decontaminazione per micropiastre UV LED ad alta intensità. Una serie di diodi emette luce UV ad alta intensità in due lunghezze d'onda - 275 nm e 365 nm - che hanno dimostrato di inattivare RNase in modo rapido e affidabile. Mentre l'array esegue la scansione attraverso la camera di decontaminazione, la luce raggiunge tutte le aree esposte in alto del vetrino o della lastra ", ha spiegato Thompson.

"La completa inattivazione dei contaminanti di laboratorio, inclusa la RNasi A, può essere eseguita dal sistema KeyPro in meno di 5 minuti e ad una frazione del costo dei metodi tradizionali."

La tecnologia KeyPro è attualmente destinata alla decontaminazione di micropiastre, vetrini preparatori e piccole superfici e funziona con una matrice di scansione di LED UV in combinazione con una piattaforma regolabile in altezza.

Il sistema KeyPro

L'uso della luce UV elimina gran parte dei problemi associati agli attuali metodi di decontaminazione. Non è necessario risciacquare ripetutamente l'attrezzatura in seguito con acqua priva di RNasi e non vi sono residui chimici, il che riduce i tempi e la potenziale contaminazione attraverso altre vie. C'è anche una minore necessità di usa e getta, riducendo i costi e gli sprechi.

Gli studi hanno anche dimostrato che tutte le comuni superfici di laboratorio, compresa la plastica, possono essere decontaminate in sicurezza attraverso questo uso della luce UV.

È stato dimostrato che i protocolli, che possono trarre vantaggio da questo, includono più tipi di sequenziamento dell'RNA, profilazione dei ribosomi e sequenziamento di RNA di nuova generazione.

Si spera che questa tecnologia possa essere ulteriormente sviluppata per consentire la decontaminazione di apparecchiature più grandi e la manipolazione delle lunghezze d'onda della luce, come ha concluso Thompson:

“È previsto un modello con una camera più grande per una maggiore flessibilità in merito alle apparecchiature che possono essere decontaminate. Oltre a ciò, abbiamo scoperto che altre lunghezze d'onda della luce possono essere utilizzate per manipolare la funzione della biomolecola, come accelerare l'attività enzimatica o denaturare selettivamente solo alcune parti della struttura molecolare di una proteina ".

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