Resolvendo o caso de contaminação por RNase

Imagem de laboratório da Biotechniques

A contaminação por RNase pode causar caos em laboratórios de análise de RNA. Quais são esses problemas e como podem ser resolvidos?

RNase: o suspeito usual

RNase é a enzima responsável pela degradação do RNA em organismos vivos. Eles desempenham um papel fundamental na maturação das moléculas de RNA e são uma primeira linha de defesa contra vírus contendo RNA, bem como na quebra de RNA antigo. Existem muitos tipos diferentes de RNase, sendo o principal tipo utilizado em laboratórios a RNase A, que tem como alvo específico o RNA de fita simples.

A RNase A é comumente descrita como uma das enzimas mais resistentes em uso em laboratório. As RNases são geralmente muito ricas em ligações dissulfeto, o que as torna enzimas incrivelmente estáveis e podem até sobreviver à autoclavagem.

Embora RNase seja um componente necessário de muitos processos biológicos, é melhor descrito como uma dor e um obstáculo para aqueles que trabalham na análise de RNA.

É incrivelmente fácil contaminar um laboratório de sequenciamento de RNA com RNase, embora seja notoriamente difícil garantir a erradicação completa. Isso se deve à presença de RNase ambiental em fontes microbianas no ar, bem como na pele, cabelo ou saliva humana.

Contaminação: o crime

Para que os experimentos de RNA tenham sucesso, parece óbvio que as moléculas de RNA devem estar o mais intactas possível. No entanto, devido à interferência da RNase, que rapidamente decompõe as moléculas de RNA quando presentes, nem sempre é esse o caso. Os pesquisadores podem então receber anormalidades, resultados inconsistentes, que causam frustração e confusão.

“As RNases são generalizadas e, ao contaminar superfícies críticas, podem apresentar problemas para os laboratórios envolvidos no sequenciamento e análise de RNA. Quantidades minúsculas de enzimas comuns, como RNase, podem tornar uma série experimental imprecisa. As técnicas padrão de descontaminação de equipamentos de laboratório podem levar horas ”, comentou Theresa Thompson, cientista de aplicação da Phoseon Technology (OR, EUA).

Contaminação RNase

Prevenir a presença física de RNase em um laboratório 'normal' seria uma expectativa irreal. Em vez disso, gerenciar a situação completamente é uma aspiração mais realista. Os pesquisadores podem reduzir as contaminações por RNase ao mínimo, abrindo frequentemente novos descartáveis e usando novos pares de luvas; uma situação que pode parecer muito familiar para o sempre cuidadoso analista de RNA. Além disso, é possível inativar moléculas de RNase por vários métodos, interrompendo sua atividade e tornando-as inúteis contra o RNA.

Esses métodos atuais de inativação de RNase tendem a ser caros, demorados e perdulários. Eles incluem tratamento DEPC de água e autoclavagem, descontaminação química de superfícies e tratamento químico de equipamentos, seguido de enxágue em água sem RNase e vidraria.

É difícil saber quando um laboratório está limpo o suficiente. Basta deixar uma pipeta em uma mesa para coletar RNase das células da pele removidas ou começar a usar um equipamento autoclavado apenas para começar imediatamente a inferir novas moléculas de RNase do ar. A autoclavagem também não destrói toda a atividade da RNase por si só, pois podem reter a atividade parcial no resfriamento à temperatura ambiente.

Embora a limpeza química possa desativar a enzima, ela deixa resíduos químicos que podem contaminar o experimento de outras maneiras.

Existe um método emergente de descontaminação por RNase que tem mostrado resultados promissores e é rápido e livre de produtos químicos. A luz ultravioleta pode inativar irreversivelmente a RNase, com estudos demonstrando que isso é possível em menos de 1 minuto.

Que haja luz!

A Phoseon Technology desenvolveu o uso de luz UV para a descontaminação de RNase em uma nova tecnologia:

“A tecnologia KeyPro ™ é um sistema de descontaminação de microplacas UV LED de alta intensidade. Uma série de diodos emite luz ultravioleta de alta intensidade em dois comprimentos de onda - 275 nm e 365 nm - comprovadamente inativando a RNase de forma rápida e confiável. Conforme a matriz faz a varredura pela câmara de descontaminação, a luz atinge todas as áreas expostas na parte superior da lâmina ou placa ”, explicou Thompson.

“A completa inativação de contaminantes de laboratório, incluindo RNase A, pode ser realizada pelo sistema KeyPro em menos de 5 minutos e por uma fração do custo dos métodos tradicionais.”

A tecnologia KeyPro é atualmente voltada para microplacas, lâminas preparatórias e descontaminação de pequenas superfícies e funciona por uma matriz de varredura de LEDs UV em combinação com uma plataforma de altura ajustável.

O sistema KeyPro

O uso de luz ultravioleta elimina muitos dos problemas associados aos métodos atuais de descontaminação. Não há necessidade de enxaguar repetidamente o equipamento posteriormente com água sem RNase e não há nenhum resíduo químico, o que reduz o tempo e a contaminação potencial por outras rotas. Há também menor necessidade de descartáveis, reduzindo custo e desperdício.

Estudos também mostraram que todas as superfícies comuns de laboratório, incluindo plástico, podem ser descontaminadas com segurança por meio do uso de luz ultravioleta.

Foi demonstrado que os protocolos, que podem se beneficiar com isso, incluem vários tipos de sequenciamento de RNA, perfil de ribossomo e sequenciamento de próxima geração de RNAs.

Espera-se que esta tecnologia possa ser desenvolvida para permitir a descontaminação de equipamentos maiores, bem como a manipulação de comprimentos de onda de luz, como concluiu Thompson:

“Está planejado um modelo com câmara maior para maior flexibilidade nos equipamentos que podem ser descontaminados. Além disso, descobrimos que outros comprimentos de onda de luz podem ser usados para manipular a função da biomolécula, como acelerar a atividade da enzima ou desnaturar seletivamente apenas certas partes da estrutura molecular de uma proteína. ”

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