Lösung des Falls einer RNase-Kontamination

Laborbild von Biotechniques

RNase-Kontamination kann in RNA-Analyselabors zu Chaos führen. Was sind diese Probleme und wie können sie gelöst werden?

RNase: Der übliche Verdächtige

RNase ist das Enzym, das für den RNA-Abbau in lebenden Organismen verantwortlich ist. Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der Reifung von RNA-Molekülen und sind eine erste Verteidigungslinie gegen RNA-haltige Viren sowie beim Abbau alter RNA. Es gibt viele verschiedene Arten von RNase, wobei der Haupttyp, der in Labors verwendet wird, RNase A ist, die spezifisch auf einzelsträngige RNA abzielt.

RNase A wird allgemein als eines der härtesten Enzyme im Labor beschrieben. RNasen sind im Allgemeinen sehr reich an Disulfidbindungen, was sie zu unglaublich stabilen Enzymen macht und sogar das Autoklavieren überleben kann.

Während RNase ein notwendiger Bestandteil vieler biologischer Prozesse ist, wird es am besten als Schmerz und Hindernis für diejenigen beschrieben, die in der RNA-Analyse arbeiten.

Es ist unglaublich einfach, ein RNA-Sequenzierungslabor mit RNase zu kontaminieren, aber es ist bekanntermaßen schwierig, eine vollständige Ausrottung sicherzustellen. Dies ist auf das Vorhandensein von Umwelt-RNase in mikrobiellen Quellen in der Luft sowie von menschlicher Haut, Haaren oder Speichel zurückzuführen.

Kontamination: das Verbrechen

Damit RNA-Experimente erfolgreich sind, müssen RNA-Moleküle so intakt wie möglich sein. Aufgrund der Interferenz von RNase, die RNA-Moleküle bei Vorhandensein schnell abbaut, ist dies jedoch häufig nicht der Fall. Den Forschern können dann Anomalien zugeworfen werden, inkonsistente Ergebnisse, die zu Frustration und Verwirrung führen.

„RNasen sind weit verbreitet und können bei der Kontamination kritischer Oberflächen Probleme für Laboratorien darstellen, die sich mit der RNA-Sequenzierung und -Analyse befassen. Winzige Mengen üblicher Enzyme wie RNase können eine Versuchsreihe ungenau machen. Standardtechniken zur Dekontamination von Laborgeräten können Stunden dauern “, kommentierte Theresa Thompson, Anwendungswissenschaftlerin bei Phoseon Technology (OR, USA).

RNase-Kontamination

Das Verhindern der physischen Anwesenheit von RNase in einem "normalen" Labor wäre eine unrealistische Erwartung. Stattdessen ist ein gründlicheres Management der Situation ein realistischeres Ziel. Forscher können RNase-Kontaminationen auf ein Minimum beschränken, indem sie häufig frische Einwegartikel öffnen und neue Paar Handschuhe verwenden. Eine Situation, die dem immer vorsichtigen RNA-Analytiker nur allzu vertraut erscheint. Darüber hinaus ist es jedoch möglich, RNase-Moleküle mit verschiedenen Methoden zu inaktivieren, ihre Aktivität zu stoppen und sie gegen RNA unbrauchbar zu machen.

Diese derzeitigen Methoden zur Inaktivierung von RNase sind in der Regel kostspielig, zeitaufwändig und verschwenderisch. Dazu gehören die DEPC-Behandlung von Wasser und Autoklavieren, die chemische Dekontamination von Oberflächen und die chemische Behandlung von Geräten, gefolgt von Spülen in RNase-freiem Wasser und Backglas.

Es ist schwierig zu wissen, wann ein Labor sauber genug ist. Alles, was es braucht, ist, eine Pipette auf einem Schreibtisch zu lassen, um RNase aus abgestoßenen Hautzellen aufzunehmen, oder ein autoklaviertes Gerät zu verwenden, nur um sofort neue RNase-Moleküle aus der Luft abzuleiten. Das Autoklavieren zerstört auch nicht die gesamte RNase-Aktivität allein, da sie beim Abkühlen auf Raumtemperatur eine teilweise Aktivität beibehalten können.

Während die chemische Reinigung das Enzym deaktivieren kann, hinterlässt sie chemische Rückstände, die das Experiment möglicherweise auf andere Weise kontaminieren können.

Es gibt eine neue Methode zur RNase-Dekontamination, die vielversprechende Ergebnisse gezeigt hat und schnell und frei von Chemikalien ist. UV-Licht kann RNase irreversibel inaktivieren. Studien haben gezeigt, dass dies in weniger als 1 Minute möglich ist.

Es werde Licht!

Phoseon Technology hat die Verwendung von UV-Licht für die RNase-Dekontamination zu einer neuartigen Technologie entwickelt:

„Die KeyPro ™ -Technologie ist ein hochintensives Dekontaminationssystem für UV-LED-Mikrotiterplatten. Eine Reihe von Dioden sendet hochintensives UV-Licht in zwei Wellenlängen - 275 nm und 365 nm - aus, das RNase schnell und zuverlässig inaktiviert. Während das Array die Dekontaminationskammer abtastet, erreicht das Licht alle oben freiliegenden Bereiche des Objektträgers oder der Platte “, erklärte Thompson.

"Die vollständige Inaktivierung von Laborkontaminanten, einschließlich RNase A, kann mit dem KeyPro-System in weniger als 5 Minuten und zu einem Bruchteil der Kosten herkömmlicher Methoden erreicht werden."

Die KeyPro-Technologie zielt derzeit auf die Dekontamination von Mikrotiterplatten, vorbereitenden Objektträgern und kleinen Oberflächen ab und arbeitet mit einer Reihe von UV-LEDs in Kombination mit einer höhenverstellbaren Plattform.

Das KeyPro-System

Durch die Verwendung von UV-Licht werden viele Probleme im Zusammenhang mit den derzeitigen Dekontaminationsmethoden beseitigt. Es ist nicht erforderlich, die Geräte anschließend wiederholt mit RNase-freiem Wasser zu spülen, und es gibt keine chemischen Rückstände, wodurch die Zeit und mögliche Kontaminationen auf anderen Wegen verkürzt werden. Es besteht auch ein geringerer Bedarf an Einwegartikeln, wodurch Kosten und Abfall reduziert werden.

Studien haben auch gezeigt, dass alle gängigen Laboroberflächen, einschließlich Kunststoff, durch diese Verwendung von UV-Licht sicher dekontaminiert werden können.

Es wurde gezeigt, dass die Protokolle, die davon profitieren können, mehrere Arten der RNA-Sequenzierung, Ribosomenprofilierung und Sequenzierung von RNAs der nächsten Generation umfassen.

Es ist zu hoffen, dass diese Technologie weiterentwickelt werden kann, um die Dekontamination größerer Geräte sowie die Manipulation von Lichtwellenlängen zu ermöglichen, wie Thompson schlussfolgerte:

„Ein Modell mit einer größeren Kammer ist für mehr Flexibilität bei der Dekontamination von Geräten geplant. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass andere Wellenlängen des Lichts verwendet werden können, um die Funktion von Biomolekülen zu manipulieren, z. B. die Enzymaktivität zu beschleunigen oder nur bestimmte Teile der Molekülstruktur eines Proteins selektiv zu denaturieren. “

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