Lösung für den Fall einer RNase-Kontamination

RNase-Kontaminationen können in RNA-Analyselaboren für Chaos sorgen. Was sind diese Probleme und wie können sie gelöst werden?

RNase: Der übliche Verdächtige

RNase ist das Enzym, das für den RNA-Abbau in lebenden Organismen verantwortlich ist. Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der Reifung von RNA-Molekülen und sind eine erste Verteidigungslinie gegen RNA-haltige Viren sowie beim Abbau von alter RNA. Es gibt viele verschiedene Arten von RNase, wobei der Haupttyp, der im Labor verwendet wird, die RNase A ist, die speziell auf einzelsträngige RNA abzielt.

RNase A wird gemeinhin als eines der widerstandsfähigsten Enzyme im Laboreinsatz beschrieben. RNasen sind im Allgemeinen sehr reich an Disulfidbindungen, was sie zu unglaublich stabilen Enzymen macht, die sogar das Autoklavieren überleben können.

Während RNase ein notwendiger Bestandteil vieler biologischer Prozesse ist, ist sie für diejenigen, die in der RNA-Analyse arbeiten, am besten als lästig und hinderlich zu bezeichnen.

Es ist unglaublich einfach, ein RNA-Sequenzierlabor mit RNase zu kontaminieren, aber notorisch schwierig, eine vollständige Ausrottung sicherzustellen. Dies ist auf das Vorhandensein von Umwelt-RNase in mikrobiellen Quellen in der Luft sowie von menschlicher Haut, Haaren oder Speichel zurückzuführen.

Kontamination: das Verbrechen

Damit RNA-Experimente erfolgreich sind, scheint es naheliegend, dass RNA-Moleküle möglichst intakt sein müssen. Aufgrund der Störung durch RNase, die RNA-Moleküle schnell abbaut, wenn sie vorhanden ist, ist dies jedoch oft nicht der Fall. Forscher können dann mit Anomalien und inkonsistenten Ergebnissen konfrontiert werden, was zu Frustration und Verwirrung führt.

"RNasen sind allgegenwärtig und können, wenn sie kritische Oberflächen kontaminieren, Probleme für Labore darstellen, die sich mit RNA-Sequenzierung und -Analyse beschäftigen. Winzige Mengen gängiger Enzyme, wie z. B. RNase, können eine Versuchsreihe ungenau werden lassen. Standardtechniken zur Dekontamination von Laborgeräten können Stunden dauern", kommentiert Theresa Thompson, Anwendungswissenschaftlerin bei Phoseon Technology (OR, USA).

RNase-Kontamination

Das physische Vorhandensein von RNase in einem "normalen" Labor zu verhindern, wäre eine unrealistische Erwartung. Stattdessen ist es ein realistischeres Ziel, die Situation gründlich zu managen. Forscher können RNase-Kontaminationen auf ein Minimum beschränken, indem sie häufig frische Einwegartikel öffnen und neue Handschuhe verwenden; eine Situation, die dem stets vorsichtigen RNA-Analysten nur allzu bekannt vorkommen mag. Darüber hinaus ist es aber auch möglich, RNase-Moleküle durch verschiedene Methoden zu inaktivieren, so dass sie nicht mehr aktiv sind und gegen RNA unbrauchbar werden.

Diese aktuellen Methoden der RNase-Inaktivierung sind in der Regel kostspielig, zeitaufwendig und verschwenderisch. Sie umfassen die DEPC-Behandlung von Wasser und das Autoklavieren, die chemische Dekontamination von Oberflächen und die chemische Behandlung von Geräten, gefolgt vom Spülen in RNase-freiem Wasser und dem Einbrennen von Glaswaren.

Es ist schwierig zu wissen, wann ein Labor sauber genug ist. Es könnte genügen, eine Pipette auf dem Schreibtisch liegen zu lassen, um RNase von abgestoßenen Hautzellen aufzunehmen, oder ein autoklaviertes Gerät zu benutzen, nur damit es sofort beginnt, neue RNase-Moleküle aus der Luft aufzunehmen. Das Autoklavieren zerstört auch nicht die gesamte RNase-Aktivität, da sie beim Abkühlen auf Raumtemperatur eine Teilaktivität beibehalten kann.

Die chemische Reinigung deaktiviert zwar das Enzym, hinterlässt aber chemische Rückstände, die das Experiment möglicherweise auf andere Weise kontaminieren können.

Es gibt eine neue Methode der RNase-Dekontamination, die vielversprechende Ergebnisse gezeigt hat und schnell und chemikalienfrei ist. UV-Licht kann RNase irreversibel inaktivieren, wobei Studien zeigen, dass dies in weniger als 1 Minute möglich ist.

Es werde Licht!

Phoseon Technology hat die Verwendung von UV-Licht zur RNase-Dekontamination zu einer neuartigen Technologie entwickelt:

"Die KeyPro™-Technologie ist ein hochintensives UV-LED-Mikroplatten-Dekontaminationssystem. Ein Array von Dioden gibt hochintensives UV-Licht in zwei Wellenlängen - 275 nm und 365 nm - ab, das nachweislich RNase schnell und zuverlässig inaktiviert. Während das Array über die Dekontaminationskammer scannt, erreicht das Licht alle von oben belichteten Bereiche des Objektträgers oder der Platte", erklärt Thompson.

"Die vollständige Inaktivierung von Laborkontaminanten, einschließlich RNase A, kann mit dem KeyPro-System in weniger als 5 Minuten und zu einem Bruchteil der Kosten herkömmlicher Methoden durchgeführt werden."

Die KeyPro-Technologie ist derzeit auf die Dekontamination von Mikroplatten, präparativen Objektträgern und kleinen Oberflächen ausgerichtet und arbeitet mit einem scannenden Array von UV-LEDs in Kombination mit einer höhenverstellbaren Plattform.

Das KeyPro-System

Die Verwendung von UV-Licht beseitigt viele der Probleme, die mit den aktuellen Methoden der Dekontamination verbunden sind. Es besteht keine Notwendigkeit, die Geräte anschließend wiederholt mit RNase-freiem Wasser zu spülen, und es gibt keine chemischen Rückstände, was den Zeitaufwand und die potenzielle Kontamination über andere Wege verringert. Es besteht auch ein geringerer Bedarf an Einwegartikeln, was Kosten und Abfall reduziert.

Studien haben außerdem gezeigt, dass alle gängigen Laboroberflächen, einschließlich Kunststoff, durch diesen Einsatz von UV-Licht sicher dekontaminiert werden können.

Es hat sich gezeigt, dass die Protokolle, die davon profitieren können, mehrere Arten von RNA-Sequenzierung, Ribosomen-Profiling und Next Generation Sequencing von RNAs umfassen.

Es ist zu hoffen, dass diese Technologie weiterentwickelt werden kann, um die Dekontamination größerer Geräte sowie die Manipulation von Lichtwellenlängen zu ermöglichen, wie Thompson abschließend feststellte:

"Ein Modell mit einer größeren Kammer ist geplant, um flexibler zu sein, welche Geräte dekontaminiert werden können. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass andere Wellenlängen des Lichts verwendet werden können, um die Funktion von Biomolekülen zu manipulieren, z. B. die Enzymaktivität zu beschleunigen oder selektiv nur bestimmte Teile der Molekularstruktur eines Proteins zu denaturieren."

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